实验室前沿——做中国最专业实验室前沿资讯网

现在的位置:主页 > 实验技术 > 医学实验室 > 病理室 >

冷冻组织切片的操作步骤

时间:2010-09-23 01:37|来源:实验室前沿| 分享|点击:


   (1)将未受损伤的组织切剖成小样本,约lcmXIcmX0.4cm。 copyright sysqy.com

    (2)将标本放在卡片的一端。标记该卡片,将带有标本的一端浸入液氮中。60s后,取出标本并放在干冰上。修剪卡片,使其大小刚好比组织块稍大些,转入预冷的(—70℃)带有标记的小瓶中。
    (3)切片前,用1%明胶包被洁净的载玻片。加热至50C使明胶溶于水中,冷却,加入0.02%叠氮钠。将玻片浸入明胶溶液中30s,取出,  自然干燥。
    (4)按照仪器使用说明书,用低温恒温器制备冷冻切片。通常切片厚度在5—10gm之间。用包被过的载玻片收集切片。  
    (5)让切片自然干燥。浸入新鲜配制的4%多聚甲醛中2min。
    (6)用PBS洗数次,放入含1%NP—40的PBS中5rain。用PBS洗数次。
    (7)将带有组织切片的载玻片放在湿盒中。加合适稀释度的一抗,用含蛋白质的溶液如3%BSA/PBS稀释抗体。
    单克隆抗体最好选用杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度为20—50gg/m1)。小鼠腹水、纯化的单克隆抗体和多克隆抗体,以及粗制的多克隆抗血清应该测试其稀释度,以使特异性抗体的浓度在0.1~10t~g/m1之间。如果特异性抗体的浓度是未知的,则制备并测试初始制品的不同稀释度(1:10,1:100,1:1000和1:10 000)。
    (8)将玻片置湿盒中于室温下孵育至少60min。对于某些反应来说,孵育时间可延长至24h,以增加其敏感性。
    (9)用PBS洗3次,每次5min以上。
    (10)加辣根过氧化物酶标记的二抗(特异性针对一抗)。这些试剂可以购自不同的经销商。如果二抗的确切用量是未知的,测试1:50—1:1000稀释的二抗。用含蛋白质的PBS稀释,如3%BSA/PBS。
    (11)将样本置湿盒中,于室温下孵育30min。
    (12)用PBS洗3次,每次5min以上。
    (13)配制DAB/金属盐试剂。将6mg DAB溶于9ml 0.05mol/L Tris缓冲液(pH7.6)中。加lm[0.3%(W/V)氯化镍贮存液(可用相同浓度的氯化钴代替)。加0.1ml 3%过氧化氢。如果出现沉淀,用Whatman 1 滤纸(或相似品)过滤。
    (14)将上述溶液加到标本中。在低倍光学显微镜下观察。当形成足够的棕/黑色沉淀时,用水冲洗以终止反应。通常这一反应过程约需1—20mino   
    (15)加数滴Harris苏木精。孵育约5min。时间长短取决于染色的强度。
    (16)用水轻柔冲洗。
    (17)通过各级乙醇使标本依次脱水。在75%乙醇中孵育两次,每次3min,95%乙醇中2次,每次3rain,100%乙醇中2次,每次3min。自然干燥。
    (18)加一小滴DPX至标本上。小心在其上面放一盖玻片(1) 避免产生气泡。用纸巾去除多余的液体。
    DPX很快可以凝固,样品便可观察并照相。
Tags:步骤,操作,组织,
责任编辑:何辉

最新更新

点击排行

更多阅读者

其他人正在阅读