(1)将未受损伤的组织切剖成小样本，约lcmXIcmX0．4cm。 copyright sysqy.com
(2)将标本放在卡片的一端。标记该卡片，将带有标本的一端浸入液氮中。60s后，取出标本并放在干冰上。修剪卡片，使其大小刚好比组织块稍大些，转入预冷的(—70℃)带有标记的小瓶中。
(3)切片前，用1％明胶包被洁净的载玻片。加热至50C使明胶溶于水中，冷却，加入0．02％叠氮钠。将玻片浸入明胶溶液中30s，取出， 自然干燥。
(4)按照仪器使用说明书，用低温恒温器制备冷冻切片。通常切片厚度在5—10gm之间。用包被过的载玻片收集切片。
(5)让切片自然干燥。浸入新鲜配制的4％多聚甲醛中2min。
(6)用PBS洗数次，放入含1％NP—40的PBS中5rain。用PBS洗数次。
(7)将带有组织切片的载玻片放在湿盒中。加合适稀释度的一抗，用含蛋白质的溶液如3％BSA／PBS稀释抗体。
单克隆抗体最好选用杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度为20—50gg／m1)。小鼠腹水、纯化的单克隆抗体和多克隆抗体，以及粗制的多克隆抗血清应该测试其稀释度，以使特异性抗体的浓度在0．1～10t~g／m1之间。如果特异性抗体的浓度是未知的，则制备并测试初始制品的不同稀释度(1：10，1：100，1：1000和1：10 000)。
(8)将玻片置湿盒中于室温下孵育至少60min。对于某些反应来说，孵育时间可延长至24h，以增加其敏感性。
(9)用PBS洗3次，每次5min以上。
(10)加辣根过氧化物酶标记的二抗(特异性针对一抗)。这些试剂可以购自不同的经销商。如果二抗的确切用量是未知的，测试1：50—1：1000稀释的二抗。用含蛋白质的PBS稀释，如3％BSA／PBS。
(11)将样本置湿盒中，于室温下孵育30min。
(12)用PBS洗3次，每次5min以上。
(13)配制DAB／金属盐试剂。将6mg DAB溶于9ml 0．05mol／L Tris缓冲液(pH7．6)中。加lm[0．3％(W／V)氯化镍贮存液(可用相同浓度的氯化钴代替)。加0．1ml 3％过氧化氢。如果出现沉淀，用Whatman 1＃ 滤纸(或相似品)过滤。
(14)将上述溶液加到标本中。在低倍光学显微镜下观察。当形成足够的棕／黑色沉淀时，用水冲洗以终止反应。通常这一反应过程约需1—20mino
(15)加数滴Harris苏木精。孵育约5min。时间长短取决于染色的强度。
(16)用水轻柔冲洗。
(17)通过各级乙醇使标本依次脱水。在75％乙醇中孵育两次，每次3min，95％乙醇中2次，每次3rain，100％乙醇中2次，每次3min。自然干燥。
(18)加一小滴DPX至标本上。小心在其上面放一盖玻片(1＃) 避免产生气泡。用纸巾去除多余的液体。
DPX很快可以凝固，样品便可观察并照相。
