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冷冻组织切片的制备

时间:2011-11-30 01:09|来源:实验室前沿| 分享|点击:


 对哺乳类组织的免疫染色研究常采用冷冻切片。就保持组织结构和抗原而言,冷冻切片是制备标本最好的方法。它的主要缺点是标本必需冷冻保存,并需要特殊的切片机如恒冷箱切片机。而许多临床标本用这种方法的效果不好,对组织结构和病理学分析主要采用福尔马林固定的石蜡包埋切片。

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    1.准备工作
    实验前先准备明胶包被的载玻片,可以在干燥冷藏的环境中放置数周。
 
    2.需要的溶液和特殊仪器
    冷冻剂,例如isopentane或OCT(详见步骤2);含0.02%叠氮钠的1%明胶;4%多聚甲醛或其他固定液;1%NP-40/PBS,PBS。
    恒冷箱切片机
 
    3.操作步骤
    (1)将样品切割成小块,约1cmXlcmX0.4cm,不能损伤组织。
    (2)如果组织非常浓厚致密,(例如皮肤、肌肉),将标本放置于卡片的边缘并将其浸没于液氮,60s后移出并放入干冰,修剪带标本的卡片,使其比组织块稍大一点,转移至标记好的预冷(—70C)的小瓶中。此外,亦可将标本在异戊烷内冷冻,再放入液氮,当样品浸没时异戊烷不会起泡,可减少冻存需要的时间,再转移至标记好的预冷(—70℃)的小瓶中。  
    如果组织的内在强度低(如脾脏、淋巴结),则将标本放置在一个含有OCT的明胶被膜中(OCT是含以下成分的混合物:聚乙烯醇、聚乙二醇和氯化二甲苯铵,  由BDH和其他公司销售;另外一些有用的冻存液是Lipshaw 1)。将此被膜在液氮中速冻,先使被膜的底部浸入,然后再全部浸入。将此被膜转移至预冷(—70℃)好的小瓶。此外,亦可在干冰平台上制一个小洼,将OCT加入,当OCT开始冻结时,将组织放入其中,使其完全冻结,然后用箔纸包裹并标记。
    组织标本在—70C可保存1年以上。密封可保存更长时间。
    (3)切片前,用1%明胶包被载玻片。将明胶溶于水,加热至50C使其溶解,冷却,再加入叠氮钠至终浓度为0.02%。将载玻片浸入此明胶液中30S,移出让其自然干燥。
    (4)应用规范化的技术制备冷冻组织切片,切片的厚度依据所研究的组织而定。一般而言,切片越薄染色越好。通常切片的厚度为5一l0um。收集切片置包被过的载玻片上。
    (5)按照组织的类型和抗原的特性,使用以下不同的步骤。
    使切片自然干燥,浸入新鲜配制的多聚甲醛(附录Ⅳ)中2rain。更换PBS洗涤数次,置入1%NP-40/PBS中5rain;
    或使切片在丙酮中固定,室温30s。
    (6)更换PBS漂洗数次。
    此时,标本可进行抗体染色。
 
    4.常见的问题
    如果使用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测方法,在加入抗体前应先阻断或抑制标本中内源性酶的活性。由于阻断过程中也可能损伤一些抗原,所以不如选择其他标记试剂。   
    阻断内源性过氧化物酶的活性可用甲醇:3%过氧化氢(按4:1的比例配制)溶液孵育标本20min。过氧化氢一般以30%的溶液贮存于4C,可以存放1个月。有些标本如脾或骨髓具有较高过氧化氢酶活性,则采用0.1%盐酸苯肼/PBS溶液处理会取得较好的效果。尽管有些资料建议单纯使用3%过氧化氢处理标本,但是本书建议不要这样做,因为剧烈的反应和气泡的形成可以破坏标本。
    阻断内源性碱性磷酸酶活性,则用0.1mmol/L左旋咪唑溶液孵育。但此抑制剂不能减少肠组织的碱性磷酸酶活性,因此,碱性磷酸酶标记的抗体不宜用于有内源性肠碱性磷酸酶标本的染色。
Tags:制备,切片,组织,冷冻,
责任编辑:何辉

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