因为抗原在细胞染色时需先固定，所以，抗体与抗原的结合比在溶液中结合需要更长的时间。孵育的时间可以根据实验设计进行相应调整，但是产生有效结合的时间一般须超过30min。通过增加二抗浓度可以缩短孵育时间。通常一些折衷办法可使二者兼颐。产生强烈的信号往往伴有高背景的问题。低浓度试剂产生的背景虽较低，但信号的强度也相应较弱。一般推荐选择相对较短的时间进行二抗的孵育(30～60min)，并应对标记二抗进行滴度测定，使其产生较低背景并形成可接受的信号强度。总之，抗体应该用含高浓度非特异性蛋白的缓冲液稀释。一般使用牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)和脱脂奶粉，或者与标记抗体相同种属的正常血清。 内容来自实验室前沿网站
1．对照
特异性染色反应应与对照进行比较。精确地评价一种染色模式，应该比较来自相同种属的两种抗体。对多克隆抗体来说，最好的对照是制备特异性抗体的同一动物的免疫前采集的血清，但是，在多数情况下，相同种属动物的非免疫血清也可以采用。对单克隆抗体而言，对照必需是和特异性抗体的来源相同，即细胞培养上清与上清对比，小鼠腹水与腹水对比，或者纯化抗体与纯化抗体相对应。如果可能，对照抗体应该是特异性抗体的同类或亚类。来自亲代的骨髓瘤细胞培养上清是绝对不适宜的对照，因其不含抗体。但来自实验室前沿美国典型培养收藏中心(theAmericantypeculturecollection，ATCC)的适当对照杂交瘤细胞系是有效的。此外，如果使用间接测定法，二级试剂亦应经过检测。当使用酶标检测法时，应该做未加任何抗体的酶反应对照，以证实某些内源性酶反应的存在与定位。
2．准备
对抗体的结合和观察最重要的准备工作是对一抗和二抗进行效价的测定。调整加入的一抗和二抗的用量，使之能得到有效强度的信号，而非特异染色较低。一般通过系列稀释各种抗体来得到这种效果(通常用含蛋白的缓冲液如3％BSA／PBS)，并在靶细胞株同时进行实验观察。1：3稀释可以很快得出一个合理的结果。对各种一抗的准备，效价滴定试验应该重复进行。而对二抗效价滴定后，就可以作为该抗体的使用标准。
3．需要的溶液和试剂
一抗、二抗(多数为商品来源)、PBS和3％／BSA／PBS。
4．操作步骤
(1)将组织切片或细胞涂片置于湿盒中。
(2)加入一抗，所有的稀释必须用含蛋白的溶液。例如，含3％BSA的PBS。单抗一般是杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度一般用20～50ul／ml)。小鼠腹水，纯化的单抗和多抗，粗制的多抗血清应该在特异性抗体浓度为0．1～long／m1稀释范围内检测。如果特异抗体浓度是未知的，则将初始材料做1：10，1：100，1：1000，1：10 000稀释。
(3)将标本片置湿盒中，室温孵育至少30min。对某些抗原抗体反应，延长孵育时间至24h，可以增加其敏感性。
(4)用PBS洗涤，换液3次，每次>5min。此缓冲液可以补加1％TritonX-100或NP-40，有助于解决背景问题。
(5)加入标记的二抗。二抗必须用含有蛋白的溶液如3％／BSA／PBS或1％免疫球蛋白／PBS(来自检测试剂的相同种属)进行稀释。常用的二级试剂包括酶或胶体金标记的抗免疫球蛋白抗体、蛋白A和蛋白G。
酶标试剂如果使用商品，检测时二抗的稀释范围在1：50～1：1000。碱性磷酸酶标记的试剂应该用Tris缓冲液稀释，不可用PBS。
金标试剂用PBS洗涤金溶胶颗粒。用含1％明胶的PBS稀释后加至标本上。
(6)将加标记二抗的标本片放于湿盒中，在室温至少孵育20min。对于金标试剂，应定期在显微镜下观察直至获得满意信号。
(7)更换PBS，漂洗3次，每次5min。
至此，标本片即可用于检测。
5．常见的问题
如果发现背景较深，常为非特异性结合所致，可以用含蛋白液体预先孵育标本而加以抑制。
一般使用的蛋白溶液是3％BSA，10％FBS(胎牛血清，因只含有低浓度的IgG)，10％干奶粉或者来自与检测试剂相同种属的纯抗体(1％)。阻断蛋白可以加在各种抗体的准备阶段，也可以在加入抗体前预先孵育标本。
