【摘要】 为探讨对免疫组化染色步骤质量控制的经验和体会，在免疫组化染色中，要求病理技师具备熟练的技能和高度的责任感，严格遵守免疫组化染色步骤外，对每个操作步骤的细节，作了经验和体会的概述。及时总结在实际工作中的经验和体会对免疫组化染色质量控制的工作是非常有益的，也是免疫组化诊断准确性的保证。 copyright sysqy.com
【关键词】 免疫组化染色;质量控制;病理诊断
免疫组化染色技术在现代病理诊断中的应用日益广泛，现已发展成为常规病理诊断中必不可少的可靠的辅助诊断手段。病理技师作为免疫组化和质量控制的具体实践参与者，是免疫组化染色成功的关键。在日常工作各个环节中，具备熟练的操作技能和高度的责任感，要熟练掌握免疫组化实验原理，对影响免疫组化染色结果的各个步骤心中有数[1]。 copyright sysqy.com
1 材料与方法 copyright sysqy.com
1.1 材料 材料均来自我院病理科石蜡切片 本文来自实验室前沿
1.2 方法 采用免疫组化SP法。试剂盒SP-9000购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 本文来自实验室前沿
2 免疫组化染色步骤
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2.1 石蜡切片脱蜡至水，用PBS(pH7.4)冲洗，每次3min×3次。 内容来自实验室前沿网站
2.2 根据一抗的要求，用抗原修复电磁炉专用不锈钢高压锅对切片进行抗原修复。0.01M pH 6.0 柠檬酸盐缓冲液1袋，用1000mL双蒸水溶解，将切片置于缓冲液中，高压锅冒汽2 min离火。 实验室前沿，了解实验室动态
2.3 切片滴加3%H2O2，放置孵育盒内15min， 本文来自实验室前沿
以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗3min×3次。
2.4 切片滴加正常山羊血清工作液封闭，室温孵育盒内15min。倾去血清，勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h或4℃冰箱过夜。 本文来自实验室前沿
2.5 PBS冲洗，3min×3次。
2.6 切片滴加生物素化二抗工作液，室温孵育盒内15min。
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2.7 PBS冲洗，3min×3次。
2.8 切片滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育盒内15min。
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2.9 PBS冲洗，3min×3次。 本文来自实验室前沿
2.10 切片滴加DAB显色液，5min。 实验室前沿，了解实验室动态
2.11 切片用自来水充分冲洗，苏木精复染，脱水透明，封固。
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2.12 光镜下切片细胞核内阳性细胞呈现棕黄色颗粒。 copyright sysqy.com
3 免疫组化染色步骤质量控制经验体会 实验室前沿，了解实验室动态
3.1 组织固定 sysqy.com
①活检组织须用10%中性福尔马林固定液固定。否则会造成蛋白弥散或降解，出现阴性染色或周边阳性中心阴性染色。
②如果过固定，会造成蛋白空间结构交联过度，即使经过抗原修复也难以出现阳性结果，或出现中心有阳性周围阴性的染色结果。 本文来自实验室前沿
3.2 控制烤片时间
①切片组织要选用肿瘤组织含量较多的组织，这样抗原决定簇多些。
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②推荐58～60℃恒温箱里烤片2h,也可在58～60℃恒温箱里过夜烤片。但不能进行高温烤片，原因是在干燥的条件下加热切片可以加速组织中抗原的氧化而破坏组织中的抗原[1]。
3.3 选择抗原修复法和控制时间
①由热引导的抗原修复能极大地改善免疫组化染色结果。采用高压加热抗原修复与微波抗原修复比较，对难以检测的细胞内和细胞核抗原，重现性更大[2]。抗原修复法有微波炉和高压锅二种修复法，比较而言，抗原修复最好使用柠檬酸缓冲液高压锅法，修复的效果最好。 内容来自实验室前沿网站
②加热时间的长短控制很重要，从切片放入缓冲液到高压锅离火源的总时间在5-8 min较好，时间过长可能会使背景染色加深。喷汽后时间掌握在2 min左右端锅，最好让切片自然冷却。 实验室前沿，了解实验室动态
③必须使用不锈钢或高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高而致掉片。 copyright sysqy.com
④高压锅离火源后须等缓冲液冷却，才能把切片取出。
3.4 滴加抗体和孵育时间 实验室前沿，了解实验室动态
①经常检查试剂是否在有效期内，随着储存时间延长，抗体的效价也会发生变化，所以应及时调整试剂的储存。 sysqy.com
②滴加一抗时，在孵育盒内轻轻甩掉封闭血清即可，但要用滤纸将切片周围和多余的液体试净，以防多余液体稀释一抗，降低效价。滴加二抗工作液和辣根酶标记链霉卵白素工作液时，尽量将玻片的液体用滤纸轻轻吸附，以防残留液体稀释二抗和工作液，出现不必要的假阴性。
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③湿盒孵育时间最好4℃冰箱过夜，这样孵育出的片子阳性率高。
3.5 设置阳性对照片
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①须用阳性切片做对照，以防出现假阳性[3]。选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。每次染色均应设阳性对照，以鉴定每次试验结果成功与否。 本文来自实验室前沿
②选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性，一般来说，阴性对照和阳性对照同时进行，或其中有阳性染色结果时才有鉴别意义。
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3.6 显色试剂配制和时间
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DAB显色剂应现用现配，显色时间不要超过5min,否则容易出现背景深染。
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3.7 掌握对比染色时间 内容来自实验室前沿网站
苏木精复染只需数秒钟。免疫组化复染只需苏木精浅淡的染色，若过深的苏木精染色有可能覆盖已有的阳性染色或与DAB显色对照效果减弱[4]。 实验室前沿，了解实验室动态
免疫组化制片是较繁琐的程序，但又是非常细致的工作。除了严格遵守免疫组化染色步骤外，及时总结在实际工作中的经验和体会对免疫组化染色质量控制的工作是非常有益的。(本文作者：怢名)
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【参考文献】
[1] 王小亚，杨清海.免疫组织化学标准化(一)[J].诊断病理学杂志，2001(1)：80.
[2] 孙琪.抗原修复技术方法的应用比较[J].宁夏医学杂志，2003，25(3):144.
[3] 孙琪.病理切片质量控制的体会[J].宁夏医学院学报，2003，25(6):444.
[4] 王小亚，杨清海.免疫组织化学标准化(二)[J].诊断病理学杂志，2008，2:160.
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