2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天
1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；
3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；
4） PBS清洗5分钟；
5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6） PBS清洗5分钟；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；
8） PBS清洗2次，每次5分钟；
9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
10）PBS清洗2次，每次5分钟；
11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12）PBS清洗5分钟；
13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；
15）杂交；第二天
16）将玻片置于SSC中以去除封片；
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17）室温，2×SSC清洗10分钟；
18）37℃，1×SSC清洗10分钟；
19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
20）缓冲液A孵育10分钟；
21）缓冲液A孵育30分钟；
22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；
23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；
24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；
26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
27）固红，脱水以及封片进行核的复染。 copyright sysqy.com
