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实验克隆失败经验总结

时间:2010-03-01 04:49|来源:实验室前沿| 分享|点击:


做不出来克隆的时间长达半年,期间克隆实验方面许多问题都遇到过,现在总结主要的一些问题和大家交流,希望大家以后不要犯我一样的错,少走弯路。
1、感受态细菌本身有质粒污染,这个问题困扰了我三个月,一直到最近才找到原因,我这里犯了最大的错是没有做过感受态检测。也许大家奇怪为什么在三个月内的时间里没有怀疑到感受态,不用奇怪,因为感受态“表现的太正常了”,每次涂板都长菌斑,每板20-30左右,很正常;我一个同学用这样的感受态做自己的克隆没有任何问题,得到了自己的克隆;我用这个感受态做T载体转化也没有问题,可以得到阳性克隆,因此很难让我想到是感受态的问题。
2、胶回收试剂盒,我用得是promega的,记住酶切产物一定要电泳之后回收,如果直接把酶切产物回收会造成大量的假阳性。这个问题困扰了我半个月。
3、我做的克隆是把大、小两个目的片段头尾相连到载体中,大小片段之间有一个共同的酶切位点,大小片段之间也有一段共同序列。由于引物设计错误,我人为地引入了一个插入突变,导致三个月的实验活白干。
4、在有经费的条件下,尽量避免改造质粒。我改造过质粒,想把质粒上的启动子删掉,中间过程很麻烦,最后也没有改造成功,因为改造后的质粒出现了一个莫名奇妙的变异——65bp的缺失突变,这个工作给我添了很多麻烦,细节就不说了。 copyright sysqy.com
5、测序长片段,比如4k左右或者以上请找一家好的测序公司,否则给克隆造成很大的影响,测序时间长不说,还有测错、测不出来等毛病。我总结的是宝生测序毛病最少,但该公司最大的问题是第一个测序反应的结果时间比较长,从送样开始到给结果需要一周。
建议大家以后注意下面的问题:
1、养成良好的实验习惯,开始接触克隆时都要做好对照,即做酶切时要做酶切对照,做转化是要做感受态对照和载体空载对照。
2、第一次做克隆时,要确定所有用到的材料都是好使的,其中最关键的是内切酶、buffer、载体、感受态大肠杆菌(常用DH5)和连接酶。如果这些都没有问题的话,就可以开始做了。
3、克隆材料没有问题的话,就要学习做克隆的相关方法,这里不再赘述了,有大量的经验心得之类的帖子可以在本网站找到。其中比较重要的是载体和连接片段的比例和大小。
4、很多有经验的人都说菌落PCR假阳性太高,这个问题我遇到过,当我把引物设计很好的时侯就避免了假阳性的出现,所以不要对菌落PCR存在偏见,关键在于引物的设计,我给T载体和pc DNA3.1都设计过筛选引物,都很好用。 copyright sysqy.com

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责任编辑:何辉

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