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IL-2的生物学测定方法

时间:2011-06-05 01:28|来源:实验室前沿| 分享|点击:


生物活性检测法是检测反应细胞对IL-2的增殖反应,以下三类细胞可作为IL-2检测细胞:①IL-2依赖细胞株,目前使用的主要有:CTLL、CTB6、F12、CTLL-2;②丝裂原活化的T淋巴母细胞;③小鼠胸腺细胞。IL-2反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或“I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。

本文来自实验室前沿

    1.3H-TdR掺人法
    (1)在96孔板中每孔加100/~L不同稀释度的IL-2待测样品,设培养液对照和不同浓度IL-2标准品对照,均做3复孔。
    (2)向各孔内加100bL检测细胞(CTLL-2 1X104/孔)。置37~(2,5%C02温箱中培养24h。
    (3)每孔加入0.5uCi  3H-TdR,继续培养4—6ho
    (4)收集细胞,检测细胞的3H-TdR掺人值,以3复孔的cpm均值表示。
    (5)按概率单位分析法计算IL-2单位
    (6)注意事项:①CTLL-2细胞对鼠IL-4亦有增殖反应,若标本中含slL-4,将影响检测结果。此时可用抗IL-4McAb处理标本后测定。但CTLL-2细胞对人IL-4无反应;②CTLL—2细胞存活率应大于95%。洗涤细胞时操作不应太剧烈,因为CTLL-2细胞膜极脆,容易破碎。
    2.12SI_UdR微量测定法  用“I-UdR代替3H-TdR的优点是不需液体闪烁测定所需试剂及设备,只需一台小型卜计数器即可。并可节省时间和减少液体闪烁测定操作中的误差。缺点是“I-UdR牛衰期较短,需定期供应。基本方法同’H-TdR掺人法。细胞培养后,每孔加0.2pCi“I-UdR,然后再加10—3mol/L 5-氟尿嘧啶5ul,继续培养24h,收集细胞,用Y-计数器检测。
    3.MIT比色分析法  原理见IL-1的检测。
(1)同3H-TdR掺人法加样品和细胞。                                                                                    
    (2)细胞培养至22—24h,每孔加入10txLMTr(5mF/mL),继续培养4ho
    (3)从每孔吸出100pL上清弃去,加酸化异丙醇100/xL/孔,充分混匀,以溶解甲、僭颗粒。
    (4)用酶标以检测波长为570nm,参考波长为630nm分别测量OD值。OD570nm—OD630nm,再减去培养液对照的OD值。
    (5)用log2稀释度(X)和各稀释度对应的OD值(Y)作直线回归。按上述概率单位分析法计算待测样品的IL-2活性单位。
    4.ConA诱导T细胞微量测定法  有丝分裂原可以使淋巴细胞转化为淋巴母细胞。淋巴母细胞表达丰富的IL-2受体,该细胞在体外IL-2存在时能持续扩大培养并与IL-2含量呈剂量依赖关系。它对有丝分裂原无反应性或反应极微。因此在无IL-2依赖细胞株的情况下,可以用此细胞作IL-2检测。
    (1)ConA诱导IL-2反应细胞制备:取C57BL/6小鼠脾脏磨碎后,配成5X106/mL单个细胞悬液。加入ConA 5//s/mL,置5%C02,37~C温箱中培养40—48h。将培养的细胞悬液置于淋巴细胞分层液上,1 700r/min离心15rain,取界面层细胞即为IL-2反应细胞(淋巴母细胞)。此细胞均为大的淋巴母细胞,并呈多角形,小的休止期细胞少于5%。
    (2)检测方法:将反应细胞配成1X106/mL$度的悬液。取0.1mL加入96孔微量培养板各孔,再加入0.1mL待测样品或已知IL-2;置5%C02,37~C温箱中培养40~48h,每孔加入0.5t~Ci/20/zL’H-TdR,继续培养4—6h,收集细胞测定’H-TdR掺人量。
    (3)注意事项:①此法不必培养CTLL-2细胞。但由于动物的个体差异,往往使试验结果批间差异较大;②淋巴母细胞的诱导和分离技术不易掌握,有时容易混入较多的休止期小淋巴细胞,这些细胞仍保留对ConA的反应性。因此,作为检测细胞所含休止期小细胞不宜超过5%,并应设ConA反应对照组;③细胞培养收获的时间一般应以无IL-2的对照细胞绝大多数死亡,而加IL-2的实验组细胞生长旺盛时为佳。
Tags:方法,测定,生物学,细胞,IL-2,培养,
责任编辑:何辉

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