1. 目的：建立对成品无菌检查的标准操作规程。 sysqy.com
2.范围：对成品的无菌检查。
3.责任：质量监督部。
4.内容：
4.1概述：无菌检查是检查药品与敷料是否染有活菌的一种方法。无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在有抑菌条件下操作。
4.2仪器、设备和用具：
4.2.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台。室内温控（25＋2）℃及除湿装置。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。
4.2.1.1无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外光灯杀菌半小时。
4.2.1.2无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板：在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。
无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。
4.2.1.3无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、75％酒精棉、碘酒棉及拖鞋等。
4.2.2恒温培养箱及可调20-25℃的生化培养箱。
4.2.3离心机、显微镜、高压消毒炉、标准pH比色器（0.02酚红指示剂和溴钾酚蓝指示剂）、恒温烤箱。
4.2.4玻璃器皿：试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1.5.10ml）、注射器（2.5.10ml）、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。使用过后如与细菌接触，应先消毒倒出内容物后再清洗，晾干。凡无菌操作过程中所用的器皿，都应包扎严密，121℃灭菌30分钟。
4.2.4.1移管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞入少许棉花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，消毒备用。
4.2.4.2试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2／3处，用牛皮纸将管口（包括塞子）包扎严，消毒备用。
4.2.4.3注射器、针头（9号、11号、12号）：将注射器与针头配对，先试验抽气、排气是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布（或布）内，包扎严密，置带盖容器（瓷盘或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎，消毒备用。
4.2.5无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，消毒备用或用一次性的物品代替。
4.2.6长柄取样匙，放于长的玻璃筒（或不锈钢长筒内），盖严，干热灭菌备用。
4.2.7手术镊、手术剪洗净，擦干。用双层纱布将1把剪刀与1个镊子间隔包扎在一起，放于带盖的容器（瓷盒或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎，灭菌备用。
4.2.8用具的灭菌：将包扎妥的用具(另有规定除外），在(121±0.5）℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。
4.3试液：
4.3.1 75％乙醇溶液配制酒精棉球用。
4.3.2 碘酊溶液配制碘酒棉球用。
4.3.3 灭菌生理盐水0.9％氯化钠溶液，分装于试管或三角瓶中，瓶口用棉塞或海棉胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。
4.3.4 新洁尔尔灭（1:1000）溶液。
4.3.5 3-5％甲酚溶液。
4.3.6 0.02％酚红指示剂pH6.8-8.4系列比色液管。
4.3.7 溴钾酚蓝指示剂pH6.0-7.6系列比色液管。
4.3.8 2mol／L盐酸溶液。
4.3.9 2mol／L氢氧化钠溶液。
4.4 培养基：
4.4.1一般采用商品干燥培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。
4.4.2新鲜配制的培养基，应按中国药典规定的处方，对培养基原材料要进行挑选，化学药品均需用CP试剂规格。
4.4.2.1除葡萄糖和指示剂外，将处方中各成分加水后置有石棉网的电炉或适宜的加热设备中，使微温溶解。用2mol /L盐酸溶液或2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值，使其比规定的pH值略高0.4-0.6，煮沸，用棉（纸）浆减压抽滤或以脱脂棉、滤纸等滤材过滤，使培养基澄清。
4.4.2.2 加入葡萄糖和指示剂溶液，摇匀，补足水量，调节pH值（比规定的pH值略高0.2-0.4），使灭菌后为7.1±0.2，分装，装量不宜超过容器的2／3，以免灭菌时溢出。
4.4.3 培养基灵敏度检查：新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。
A 需气菌、厌气菌培养基，用藤黄微球菌和生孢梭菌两种菌检查。
取藤黄微球菌[Micrococcu Iutea CMCC（B） 28001］的新鲜斜面培养物，加灭菌生理盐水约3ml，制成均匀的菌悬液，然后以10倍系列稀释后并计数，将该菌稀释成1:105-1:108的系列浓度管。
取生孢梭菌[Clostridium sporogones CMCC（B）64941]的需气、厌气培养基的新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用灭菌生理盐水制成均匀菌悬液，照上述方法进行稀释并计数，将该菌稀释成1:106一1:109系列浓度管。
B 霉菌培养基用白色念珠菌检查
取白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001］霉菌琼脂培养基斜面的新鲜培养物，接种至霉菌培养基内， 20-25℃培养24小时。照藤黄微球菌项下方法稀释及计数。将该菌稀释成1:105-1:108系列浓度管。
C 将上述制备的各菌的系列浓度管各1ml，分别接种于9ml试验培养基中，每个稀释浓度至少接种3管，以未接种的培养基管对照，细菌试验管置30-35℃培养3天，白色念珠菌试验管置20-25℃培养5天，逐日记录结果。
D 结果判断以接种后培养基管数的2／3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种量均应小于10个菌落），3次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判断标准。
需气菌、厌气菌培养基灵敏度藤黄微球菌1:106,生孢梭菌1:107，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:106。
4.4.4配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周，临用前细菌和霉菌培养基分别经30-35℃和20-25℃培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用。
4.4.5需气菌、厌气菌培养基在试管中装量高度不得少于7Cm，其指示剂氧化层不得超过培养基深度的1／5，否则须经水浴煮沸10分钟，但只限加热一次。无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的1／2。
4.5对照用菌液的制备：
4.5.1试验用菌种、菌种的复苏、菌种的接种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。
4.5.2金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus CMCC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至相同培养基内，在30-35℃培养16-18小时，用灭菌生理盐水稀释成1:106
4.5.3生孢梭菌菌液用接种环取生孢梭菌[C1ostrldiu sporogones CMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同培养基内，在30-35℃培养18-24小时，用灭菌生理盐水稀释成1:106。
4.5.4白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌[Candidaalbicans CMCC（F）98001]的霉菌琼脂培养基斜面培养物少许，接种至霉菌培养基内，在20-25℃培养24小时，用灭菌生理盐水稀释成1:105。
4.5.5上述制备的菌液，一般当日使用。
4.6检查法的操作：
4.6.1 供试品、培养基在移入缓冲间之前应先编号，并用0.1％新洁尔灭或酒精棉擦拭瓶（管）外壁，然后连同其它用具（包括无菌衣、帽、口罩等）移入缓冲间，打开无菌间紫外光灯和空气过滤装置开关并使其工作在1小时以上。
4.6.2操作人员用肥皂水清洗双手，关闭紫外光灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用碘酒棉、酒精棉擦手，穿戴衣、帽、口罩。将所需全部物品剥去牛皮纸，移入无菌操作室，每次试验中所用物品必须计划好，并有备用物。
4.6.3供试品外部消毒：
4.6.3.1 粉针剂、油剂等橡皮塞铝盖压封小瓶先用75％酒精棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用消毒镊子剔去铝盖上的铝质小圆片。用碘酒棉球拭抹瓶盖及橡皮塞，再用75％酒精棉球擦去碘酒，并将酒精棉球盖于橡皮塞上待取样。
4.6.3.2安瓶针剂先用碘酒棉球将安瓶外部擦拭消毒，待干，用砂轮或灭菌锉轻割安瓶颈部（便于折开安瓶），再用75％酒精棉将碘酒擦净，待干。
4.6.4供试品制备：用灭菌镊取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，供试品瓶盖和注射器针头均应迅速通过火焰数次，当供试品为粉针剂，瓶盖为橡皮塞时，用注射器吸取规定的溶剂在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入小瓶加入溶剂，使溶解，混匀后，吸出溶液；如为注射液可直接用注射器吸取药液。按规定须稀释或灭活的供试品，可直接或将瓶内供试液抽出至灭菌玻璃容器内进行灭活处理并稀释至规定的体积和浓度；需加入空气加压后便于抽出的供试品应用注射器对着火焰抽取空气加入，抽取瓶中内容液体时，应将供试品倒置并使针头在液面下。
4.6.5直接接种法：除正文中另有规定外，随机抽取2支（瓶）或2份（原料药）以上，按上述操作进行外部消毒和制备后吸取规定接种量的供试品溶液，在近火焰上以右手半握拳，小指为主拔开培养基管的塞子，再移至火焰下侧沿着培养基管壁分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管（其中1管于操作结束后移至接种室接种对照菌液1ml，供作阳性对照）；注入供试液时，切勿向液面直射，以免将空气中的氧带入培养基中，并在火焰旁将塞子塞严，另接种于霉菌培养基2管。供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量，按下表规定取用：
供试品溶液的每管接种量与培养基分装量
供试品装量（ml） 每管接种量（ml） 培养基分装量（ml）
2ml或2ml以下 0.5 10
接种后轻轻摇动，使匀，需气菌、厌氧菌培养基在30-35℃培养5日，霉菌培养基在20-25℃培养7日，培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有细菌生长），并填写无菌检查记录表。如在加入供试品溶液后培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取该培养液种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48-72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在接种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
4.7结果判断：当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长时，可根据观察所得的结果判定，如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何管显混浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法复试2次，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。
