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不同样品DNA提取的技巧(2)

时间:2010-01-12 02:59|来源:实验室前沿会员投稿| 分享|点击:



  (一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
  1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
  2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
  3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
  4. 室温下5000rpm离心5分钟。
  5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
  6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
  7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。
  8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
  9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。
  10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 实验室前沿,了解实验室动态
  11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
  12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
  13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
  [注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
  (二). 从李(苹果)叶子提取基因组DNA
  1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。
  2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。
  3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。
  4. 同本节(一)中步骤3-13操作。
(6) 石蜡包埋组织的DNA提取
  医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织,是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法,是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。Goelz(1985)和Dubeau等(1986 )成功地从蜡块中提取出高质量的DNA,完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要, 结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针,诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。 sysqy.com
一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法
从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤,是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等(1985)最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术,是用机械的方法破碎组织,切除多余的石蜡,进入含SDS和高浓度蛋白酶K(1mg/ml)的提取缓冲液加温孵育,然后进行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA虽不完整,但可被限制性内切酶切割,因而适于点杂交,印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等(1986)在上述方法上作了改进。 首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡,保证了组织的完全破碎,使细胞与消化液充分接触,使DNA释放和蛋白去除更加完全;其次通过两步消化的方法,将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除,仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子,从而提DNA质量,适于做Sorthern印迹杂交分析。Moerkerk等(1990)对上述两种方法进行了比较,发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致,非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
Goelz氏DNA提取方法的主要步骤
1.切除多余石错,暴露组织
2.将组织切碎(最大径<0.5mm),称重;
3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50-500mg/10ml),高速混悬2-3min,于48℃放置24h
      TE9提取液的制备
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           500mmol/L Tris
           20mmol/L EDTA
           10mmol/L NaCl
           1% SDS
           500 μg/ml 蛋白酶K
           pH8.0
4.再次混悬组织,加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%,孵育40h;
5.用等体积酚-氯仿溶液抽提3次;
6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA
7.-70℃放置2-4h
8.9 000xg离心1h
9.沉淀物用70%乙醇洗1次
10.干燥,TE(pH7.2)溶解。
Tags:技巧,提取,不同,DNA,组织,固定,影响,蛋白,离心,方法
责任编辑:何辉

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