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不同样品DNA提取的技巧

时间:2010-01-12 02:59|来源:实验室前沿会员投稿| 分享|点击:


 各种不同样品DNA提取的技巧:
(1)福尔马林浸泡标本的DNA提取
1.     福尔马林对DNA有一定的破坏作用,因此提取的工作很有难度。如果有条件最好使用试剂盒,另外组织尽量不要取边缘的,用PBS洗上几次,延长蛋白酶消化时间。提出的DNA先用分光光度计测一下含量,要是A260/280值小于1.8或大于2.2,就不要跑电泳了。若要跑电泳,最好在DNA提取后的48小时之内,否则会对条带有影响。
2.     福尔马林固定组织可以获得高质量DNA,但是由于固定后DNA发生断裂,所以与新鲜组织相比较,DNA片段要短一些。这种DNA用于短距离PCR是没有问题的,如果是长距离PCR可能会影响效果。
(2)从小鼠胸腺细胞中提取基因组DNA做PCR:
1.       由培养的细胞提基因组DNA做PCR,每次取1毫升左右的培养液,提取后即可做PCR了.
2.       一般来讲取少量细胞直接加入PCR反应体系中也是可以的。如果一定要提基因组DNA,那么用10的5次方就够了。
(3)从血液中提取DNA的常见问题: 在血液DNA的提取中,为什么用EDTA抗凝比用肝素抗凝要好?
高盐法与酚-抽提法对PCR的结果影响有什么不同? 解答: 本文来自实验室前沿
1.  EDTA可以破坏蛋白质与DNA的结合,使DNA释放出来,并且可以有效的抑制DNA酶的活力,而肝素的不能有效的抑制DNA酶的活力。
2. 酚-抽提法制备的DNA,产量高,纯度大,可用于限制酶切反应及测序。
3. 也有的实验者采用枸橼酸盐抗凝,但据一起做实验的人说,用EDTA抗凝和用肝素抗凝均可,因为有人用肝素抗凝也能做出结果来。至于高盐法与酚-抽提法对PCR的结果影响,对PCR结果并无太大影响,但苯酚,氯仿等有机试剂确实对Taq酶的活性有影响,盐析法的效率要高一些。国内也有人做过对比,认为两种方法提取的DNA纯度均可满足PCR要求,但盐析法的提取效率要高一些。
4.建议有凝血块时可以试一试用酚-抽提法,一般情况下采用高盐法就可以了.
(4)组织提取DNA的方法:
从动物组织提取基因组DNA
  一、材料
  哺乳动物新鲜组织。
  二、设备
  移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
  三、试剂
  1、分离缓冲液:10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
  2、其它试剂:10% SDS,蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂),乙醚,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),无水乙醇及70%乙醇,5mol/L NaCl,3mol/L NaAc,TE。 copyright sysqy.com
  四、操作步骤:
  1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
  2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。
  3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
  4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。
  5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。
  6.取上清液于新离心管,用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。
  7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
  8. 移去上层乙醚,保留下层水相。
  9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物。10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。
  11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。 内容来自实验室前沿网站

(5)从植物组织提取基因组DNA
  一、材料
  水稻幼苗或其它禾本科植物,李(苹果)幼嫩叶子。
  二、设备
  移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。
  三、试剂
  1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
  2、提取缓冲液Ⅱ:18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240ul巯基乙醇,加水至300ml。
  3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
  4、 RnaseA母液:配方见第一章。
  5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
  四、操作步骤:

Tags:技巧,提取,不同,DNA,组织,固定,影响,蛋白,离心,方法
责任编辑:何辉

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