实验室前沿——做中国最专业实验室前沿资讯网

现在的位置:主页 > 实验技术 > 医学实验室 > PCR室 >

新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第四版)(操作流程)

时间:2020-05-15 16:44|来源:互联网| 分享|点击:


2月6日,国家卫生健康委发布了新型冠状病毒感染的肺炎防控方案(第四版),同时作为附件发布了新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)。

一、标本采集

本文来自实验室前沿

(一)采集对象。

本文来自实验室前沿

新型冠状病毒肺炎疑似病例、临床诊断病例(仅限湖北省)和聚集性病例,其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者,或其他需要进一步筛查检测的环境或生物材料(如溯源分析)。

sysqy.com

(二)标本采集要求。

sysqy.com

1.从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训(培训合格)和具备相应的实验技能。

实验室前沿,了解实验室动态

采样人员个人防护装备(personal protective equipment,PPE)要求: 本文来自实验室前沿

N95 及以上防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水靴套; 内容来自实验室前沿网站

如果接触了患者血液、体液、分泌物或排泄物,应及时 更换外层乳胶手套。 sysqy.com

2.住院病例的标本由所在医院的医护人员采集。

内容来自实验室前沿网站

3.密切接触者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责 采集。 内容来自实验室前沿网站

4.根据实验室检测工作的需要,可结合病程多次采样。 内容来自实验室前沿网站

(三)标本采集种类。 copyright sysqy.com

每个病例必须采集急性期呼吸道标本(包括上呼吸道标本 和下呼吸道标本); 实验室前沿,了解实验室动态

重症病例优先采集下呼吸道标本(如支气管 或肺泡灌洗液等);

sysqy.com

出现眼部感染症状的病例,需采集眼结膜拭子标本;

本文来自实验室前沿

出现腹泻症状的病例,需留取便标本。 内容来自实验室前沿网站

可根据临床表 现与采样时间间隔进行采集。 sysqy.com

其他研究材料依据设计需求采集。

内容来自实验室前沿网站

标本种类:

sysqy.com

1.上呼吸道标本:

本文来自实验室前沿

包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物等。 内容来自实验室前沿网站

2.下呼吸道标本:

本文来自实验室前沿

包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管 灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。

本文来自实验室前沿

3.血液标本: 实验室前沿,了解实验室动态

尽量釆集发病后7天内的急性期抗凝血。 内容来自实验室前沿网站

采集量5ml,以空腹血为佳,建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液。

实验室前沿,了解实验室动态

4.血清标本:

sysqy.com

尽量釆集急性期、恢复期双份血清。

sysqy.com

第一份 血清应尽早(最好在发病后7天内)釆集,第二份血清应在发病 后第3~4周釆集。 实验室前沿,了解实验室动态

采集量5ml,建议使用无抗凝剂的真空釆血管。

实验室前沿,了解实验室动态

血清标本主要用于抗体的测定,从血清抗体水平对病例的感染状况进行确认。血清标本不进行核酸检测。 sysqy.com

5.眼结膜标本:出现眼部感染症状的病例需采集眼结膜拭 内容来自实验室前沿网站

子标本。

本文来自实验室前沿

6.便标本:

内容来自实验室前沿网站

出现腹泻症状的患者需采集便标本。

内容来自实验室前沿网站

(四)标本采集方法。

本文来自实验室前沿

1.咽拭子: 本文来自实验室前沿

用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,将拭子头浸入含3ml病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中,尾部弃 去,旋紧管盖。 实验室前沿,了解实验室动态

2.鼻拭子: sysqy.com

将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻 道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。

sysqy.com

取另一根聚丙烯纤维 头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。

本文来自实验室前沿

上述两根拭子 浸入同一含3ml采样液的管中,尾部弃去,旋紧管盖。 实验室前沿,了解实验室动态

3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物:

copyright sysqy.com

用与负压泵相连的收集器 从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。

copyright sysqy.com

将收集器头部 插入鼻腔或气管,接通负压,旋转收集器头部并缓慢退出,收集抽取的粘液,并用3ml采样液冲洗收集器1次(亦可用小儿导 尿管接在50ml注射器上来替代收集器)。

sysqy.com

4.深咳痰液: copyright sysqy.com

要求病人深咳后,将咳出的痰液收集于含3ml 采样液的50ml螺口塑料管中。

内容来自实验室前沿网站

5.支气管灌洗液:

本文来自实验室前沿

将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管(约30cm深处),注入5ml生理盐水,接通负压,旋转收集 sysqy.com

器头部并缓慢退出。

内容来自实验室前沿网站

收集抽取的粘液,并用采样液冲洗收集器1 次(亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集)。

内容来自实验室前沿网站

6.肺泡灌洗液: sysqy.com

局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经 过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管,将其顶端契入支气管 分支开口,经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水,每次30~50 ml,总量100~250ml,不应超过300ml。

内容来自实验室前沿网站

7.血液标本: copyright sysqy.com

建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集 血液标本5ml,室温静置30分钟,1500~2000rpm离心10分钟, 分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。

copyright sysqy.com

8.血清标本:

copyright sysqy.com

用真空负压采血管采集血液标本5ml,室温静 置30分钟,1500~2000rpm离心10分钟,收集血清于无菌螺口塑 料管中。

copyright sysqy.com

9.粪便标本:

sysqy.com

如患者发病早期出现腹泻症状,则留取粪便 标本3-5ml;

sysqy.com

10.眼结膜拭子标本:

sysqy.com

眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后,将 拭子头进入采样管中,尾部弃去,悬紧管盖。

本文来自实验室前沿

其他材料:依据设计需求规范采集。

本文来自实验室前沿

(五)标本包装。 本文来自实验室前沿

标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。 本文来自实验室前沿

1.所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里,拧紧。 实验室前沿,了解实验室动态

容器外注明样本编号、种类、姓名及 采样日期。

copyright sysqy.com

2.将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封,每袋装 一份标本。 本文来自实验室前沿

样本包装要求要符合《危险品航空安全运输技术细 则》相应的标准。 内容来自实验室前沿网站

3. 涉及外部标本运输的,应根据标本类型,按照A类或B类 感染性物质进行三层包装。 实验室前沿,了解实验室动态

(六)标本保存。 实验室前沿,了解实验室动态

用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测,能在24 小时内检测的标本可置于4℃保存;

copyright sysqy.com

24小时内无法检测的标本则 应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件,则于-20℃冰箱 暂存)。

本文来自实验室前沿

血清可在4℃存放3天,-20℃以下可长期保存。

本文来自实验室前沿

应设立 专库或专柜单独保存标本。

copyright sysqy.com

标本运送期间应避免反复冻融。 实验室前沿,了解实验室动态

(七)标本送检。 copyright sysqy.com

标本采集后应尽快送往实验室,如果需要长途运输标本,建议采用干冰等制冷方式进行保藏。 本文来自实验室前沿

1.上送标本。

内容来自实验室前沿网站

各省(自治区、直辖市)聚集性病例的标本,上送中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所进行检测复核,并附样本送 检单(见附件)。 实验室前沿,了解实验室动态

2.病原体及标本运输。

本文来自实验室前沿

2.1 国内运输。 sysqy.com

新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类,对应的联合国编号为UN2814,包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI602分类包装要求;环境样本属于B类,对应的联合国编号为UN3373, 包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI650分类包装要求;通过其他交通工具运输的可参照 以上标准包装。新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性材料运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规 定》(原卫生部令第45号)办理《准运证书》。

内容来自实验室前沿网站

2.2 国际运输。 copyright sysqy.com

新型冠状病毒毒株或样本在国际间运输的,应规范包装,按照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续,并满足相关国家和国际相关要求。

内容来自实验室前沿网站

2.3 毒株和样本管理。 sysqy.com

新型冠状病毒毒株及其样本应由专人管理,准确记录毒株和样本的来源、种类、数量,编号登记,采取有效措施确保毒 株和样本的安全,严防发生无用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。

本文来自实验室前沿

二、新型冠状病毒的实验室检测

本文来自实验室前沿

新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光RT-PCR 鉴定。 内容来自实验室前沿网站

任何新型冠状病毒的检测都必须在具备适当条件的实验 室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。 内容来自实验室前沿网站

本指南中的核酸 检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab(open reading frame 1ab , ORF1ab ) 和 核 壳 蛋 白 ( nucleocapsid protein,N)。

sysqy.com

在实验室要确认一个病例为阳性,满足以下条件: copyright sysqy.com

同一份标本中新型冠状病毒2个靶标(ORF1ab、N)特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的 检测结果,则需要重新采样,重新检测。 本文来自实验室前沿

阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染,需要排除可能产生假阴性的因素,包括:

样本质量差,比如口咽等部位的呼吸道样本;

实验室前沿,了解实验室动态

样本收集的过早或过晚; copyright sysqy.com

没有正确的保存、运输和处理样本; copyright sysqy.com

技术本身存在的原因,如病毒变异、PCR抑制等。

实验室前沿,了解实验室动态

三、实时荧光 RT-PCR 方法检测新型冠状病毒核酸

copyright sysqy.com

(一)目的。

sysqy.com

规范实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的工作程序,保证实验结果的正确可靠。

sysqy.com

(二)范围。

本文来自实验室前沿

适用于实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸。

copyright sysqy.com

(三)职责。

本文来自实验室前沿

检测人员:负责按照本检测细则对被检样本进行检测。 实验室前沿,了解实验室动态

复核人员:负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核。

本文来自实验室前沿

部门负责人:负责对科室综合管理和检测报告的审核。 sysqy.com

(四)样本接收和准备。

sysqy.com

核对被检样本姓名、性别、年龄、编号及检测项目等;

内容来自实验室前沿网站

待检样本的状态如有异常,需注明;

copyright sysqy.com

待检样本应存放于-70℃冰箱保存。

实验室前沿,了解实验室动态

(五)检测项目。 sysqy.com

1.新型冠状病毒核酸测定(实时荧光RT-PCR方法) 推荐选用针对新型冠状病毒的ORF1ab、N基因区域的引物和探针。 sysqy.com

靶标一(ORF1ab): 本文来自实验室前沿

正向引物(F): 实验室前沿,了解实验室动态

CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物(R):

本文来自实验室前沿

ACGATTGTGCATCAGCTGA sysqy.com

荧光探针(P):

本文来自实验室前沿

5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3' 实验室前沿,了解实验室动态

靶标二(N): 内容来自实验室前沿网站

正向引物(F): 实验室前沿,了解实验室动态

GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 反向引物(R):

内容来自实验室前沿网站

CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

sysqy.com

荧光探针(P):

copyright sysqy.com

5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' 本文来自实验室前沿

核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系及反应条件参考相关厂家试剂盒说明。 实验室前沿,了解实验室动态

2.结果判断 阴性:无Ct值或Ct≥40。

sysqy.com

阳性:Ct值<37,可报告为阳性。 sysqy.com

灰度区:Ct值在37-40之间,建议重复实验,若重做结果Ct

sysqy.com

值<40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。 copyright sysqy.com

注:如果用的是商品化试剂盒,则以厂家提供的说明书为准。

内容来自实验室前沿网站

四、病原生物安全实验活动要求

copyright sysqy.com

根据目前掌握的新型冠状病毒的生物学特点、流行病学特征、临床资料等信息,该病原体暂按照病原微生物危害程度分 类中第二类病原微生物进行管理,具体要求如下:

内容来自实验室前沿网站

(一)病毒培养。 本文来自实验室前沿

病毒培养是指病毒的分离、培养、滴定、中和试验、活病毒及其蛋白纯化、病毒冻干以及产生活病毒的重组实验等操作。 copyright sysqy.com

上述操作应当在生物安全三级实验室的生物安全柜内进行。

copyright sysqy.com

使用病毒培养物提取核酸,裂解剂或灭活剂的加入必须在与病毒 培养等同级别的实验室和防护条件下进行,裂解剂或灭活剂加 入后可比照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。

内容来自实验室前沿网站

实验室开展相关活动前,应当报经国家卫生健康委批准,取得开展 相应活动的资质。 本文来自实验室前沿

(二)动物感染实验。 内容来自实验室前沿网站

动物感染实验是指以活病毒感染动物、感染动物取样、感染性样本处理和检测、感染动物特殊检查、感染动物排泄物处 理等实验操作,应当在生物安全三级实验室的生物安全柜内操作。 实验室前沿,了解实验室动态

实验室开展相关活动前,应当报经国家卫生健康委批准, 取得开展相应活动的资质。

实验室前沿,了解实验室动态

(三)未经培养的感染性材料的操作。 本文来自实验室前沿

未经培养的感染性材料的操作是指未经培养的感染性材料在采用可靠的方法灭活前进行的病毒抗原检测、血清学检测、 核酸提取、生化分析,以及临床样本的灭活等操作,应当在生物安全二级实验室进行,同时采用生物安全三级实验室的个人 防护。 copyright sysqy.com

(四)灭活材料的操作。 实验室前沿,了解实验室动态

感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的核酸检测、抗原检测、血清学检测、生化分析等操作应当在生物安全二级实验室进行。 实验室前沿,了解实验室动态

分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作, 可以在生物安全一级实验室进行。
  sysqy.com

Tags:新型,冠状,病毒,肺炎,实验室,检测,技术指南,第四,操作,
责任编辑:小平

最新更新

点击排行

更多阅读者

其他人正在阅读