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食品霍乱弧菌的检验方法

时间:2010-03-01 04:28|来源:实验室前沿| 分享|点击:次

1．仪器和设备

1．1恒温培养箱：36±1℃

1．2恒温水浴箱：45±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4拍打式均质器

1．5菌落计数器

1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm

1．7锥形瓶:500ml 250ml

1．8平皿：直径为90mm

1．9灭菌盒和枪头

1．10灭菌袋

1．11酒精棉

1．12天平:感量0.1g

1.13冰箱：0-4℃和-15～-20℃

2．培养基的制备

2．1碱性蛋白胨水

称取15g干粉于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装，121℃10min高压灭菌。

2．2硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）

称取89.1g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至55℃倾注平板备用。

2．3三糖铁（TSI）

称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm×100 mm，每管约2～4ml，115℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。

2．4霍乱双糖铁琼脂（KIA）

称取64.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装。121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。

2．5T₁N₁琼脂

称取35g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15分钟高压灭菌。倾注平板备用。

在上项成分中改变氯化钠的含量，去除琼脂可制成T₁N₀ 和T₁N₃肉汤。

2．6精氨酸葡萄糖斜面琼脂（AGS）

称取58g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。

2．7 O/F实验用培养基（HLGB）

称取45.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每管3ml（有的加矿物油覆盖）121℃15分钟高压灭菌备用。

2．8赖氨酸脱羧酶肉汤生化管

2．9MR-VP肉汤生化管

3.1样品的分离培养和初步鉴定:

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注：霍乱弧菌菌落特征形状大，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。

霍乱弧菌初步鉴定试验中的反应

	KIA			TSI			T₁N₀	T₁N₃
	斜面	底层	斜面	底层	斜面	底层	T₁N₀	T₁N₃
霍乱弧菌			A(K少见)	A	A	a	＋	＋
注：K-碱性；A-酸性；a-微酸性。

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霍乱菌属细菌在TSI、KIA、AGS中不产H₂S，也不产气。一些气单胞菌属菌株可能产气。

3．2确认试验

以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的T₁N₃培养物，分别接种到以下培养基：

Hugh-Leifson葡萄糖肉汤（HLGB），36±1℃培养18~24h。

ONPG胨水，36±1℃培养1h～3h或24h。

赖氨酸脱羧酶肉汤，36±1℃培养24~96h。

阿拉伯糖肉汤，36±1℃培养24h。

O/129试验用培养基，36±1℃培养18~24h。

霍乱弧菌的生化反应表

生化项目	生化性状	生化项目	生化性状
TCBS	Y	D-甘露糖	＋
AGS	Ka	氧化酶ONPG	＋
Nacl 0％	＋	V-P	v
3％	＋	精氨酸双水解酶	－
6％	－	赖氨酸脱羧酶	＋
8％	－	鸟氨酸脱羧酶	＋
10％	－	抑菌试验
42℃生长	＋	10ugO/129	S
蔗糖	－	150 ugO/129	S
D-纤维二糖	－	明胶酶	＋
乳糖	－	尿素酶	－
阿拉伯糖	－
注：Y-黄色；K-碱性；＋-80％或更多的菌株阳性；－-80％或更多的菌株阴性；v-依据种或菌株的可变反应；S-敏感；AGS-精氨酸-葡萄糖斜面。所有试验均不产H₂S和气体。