DNA序列分析是从噬菌体展示的蛋白质或多肽文库中，鉴定出优化的变异体的首选方法。在DNA水平或翻译后(氨基酸序列)水平进行序列比对都是很有用的。
本文来自实验室前沿
1 测序的时机
在当代全自动DNA测序仪的帮助下，很多克隆的全序列(可读框)都可以在大约几小时内得到。我们通常在富集度已达到最高之后开始对各克隆进行测序。这在单价噬菌体展示体系中，通常发生在3～6个结合筛选—扩增的循环后。一个推荐的策略，就是从富集度为10倍或更高倍数首次出现的那一轮开始，每轮挑选10～20个克隆进行测序。由于从靶标上洗脱的噬菌体比本底高lo倍，可以预测全部克隆约有90％都与靶标有特异性结合。可用单孔分析来确定阳性克隆。
应该把这些序列按突变产生处排列在一起，用人工或电脑分析评估是哪些氨基酸出现在随机化位置中。筛选出的文库中的克隆应该是完整的，并且被展示蛋白质的基因以及它与噬菌体衣壳蛋白基因的融合基因都有正确的可读框，要确保这一点是很重要的。有可能移码的或删除的变异体占统治地位，但针对作为对照的基质以及针对作为负对照的噬菌体的阳性富集度，却在不能在这种情况中被观测到。在这个阶段文库中往往还保留有序列的多样性，为了筛选出具有更高亲和性的克隆，结合筛选也许还能在逐渐提高的选择压下继续进行。
2 序列的一致和同源
可以观察到两种序列收敛的类型(convergence，即趋于相同)。一种类型是“同源”(sibs)，它发生在一个单一的DNA克隆在一系列筛选出的变异体中占统治地位时。例如：如果使用NNS简并，则有两个可能的密码子编码Val(GTC和GTG)。假设在筛选出的文库中，编码(Val)4的GTC-GTC-GTC-GTC序列占统治地位，如果没有发现其他的15种O可能的密码子组合方式(如GTG-GTC-GTC-GTC)，那么有可能文库中主要含有筛选出的这种克隆。这可能是由表达的倾向性、发生在载体里另外的位点中的不在预期之内的突变，或是从文库中取出的有限的样本所导致的结果。进一步的测序是必要的，尤其是当样本取自前面的几轮筛选时。但是要注意，有些氨基酸残基只由一个密码子编码(如用NNS密码子时的Trp或Met)，所以这种检验不是总是有意义的。同源的发生不排除有亲和性改进的变异体的发现。
在另一种类型的序列收敛情况中，特殊的氨基酸序列占统治地位，但密码子在一个或更多的位置上有差异。例如：编码Met-Arg-Ala的ATG-CGG-GCC、ATG-AGG-GCC、ATG—CGC-GCG和ATG-CGC-GCC都有可能被找到。这种类型的结果让我们高度相信：筛选出的文库具有合适的多样性；筛选的进行基于氨基酸序列结合特性的倾向性，而不基于依赖DNA的效果的倾向性(如表达水平)。
3 对一致性的评价
除非只有一个多肽序列占统治地位，否则就有必要评价得到的一致性序列在何种程度上表述随机取样序列之间的显著偏差。这有几种手段可以使用。
我们构建了一种评分函数，来观测描述原始文库理论上的(或者说是在理想状态下由实验测定的)多样性、密码子简并性以及每种氨基酸被观测到的次数的S值。函数式表达为：S＝(Pf－Pe)/[Pe(1－Pe)/n]1/2。其中Pf是观测到的一个特定氨基酸残基的频率，即观测到的次数除以所有克隆的总数目n；Pe是基于密码子简并性或理想的基于筛选前对文库测序结果(计算关于上文的Pf值的户，值)的每个氨基酸残基的期望频率。在我们的实验中，S>2的评分代表功能上的重要作用。
4 对噬菌体克隆的评价
可以使用几种方式来评价从噬菌体结合筛选中分离出的克隆的亲和性及特异性。通常可以在噬菌体水平定量地评测蛋白质结合相互作用，可以在单克隆上，甚至在一系列从结合筛选的不同阶段挑选出的克隆中实现这一点。
蛋白质不同位点上点突变的结果，对结合的自由能的影响常常是叠加的。对许多噬菌体进行优化的努力，都使用了这个原理来联合我们从各个独立的文库中筛选出的、只针对少量残基的各个突变。可以使用ELISA来评定对叠加作用(additivity)及积累的亲和性的改进。
当突变不是叠加性的时候，可以使用积累的随机化突变及筛选。这里的策略是从特定的文库中筛选一个优化后的变异体，然后以这个变异体为模板，在新的位置上进行随机化突变。用这个策略结合叠加作用，得到了一个在15个位点上进行了突变的、亲和性提高了400倍的激素变异体E22]。原始多肽文库的引导肽的成熟，也使用了这个策略。
如上所述，在用于文库筛选的同一个噬菌粒载体中，琥珀终止密码子的使用允许在大肠杆菌中快速制备可溶性蛋白变异体。多肽或蛋白质的变异体也可以与表位标签融合后进行表达，以使纯化变简单。由于可溶性蛋白质表达、复性和纯化的细节可能和现有的蛋白质或多肽有很大不同，我们没有在这里列出特别的实验方案。对于在大肠杆菌中蛋白质的高水平表达，读者可以考虑参考Makrides的综述。
