在印迹膜经过处理可用于抗原检测之前，须再进行封闭以防免疫试剂的非特异性吸附。检测过程是连续进行的。将印迹膜与一定浓度的蛋白质或去污剂溶液孵育可实现封闭。然后通过抗体与在固定膜上的蛋白质结合来定位抗原。抗原可用易识别的示踪剂标记的抗体进行检测。抗体本身可以标记，直接用于检测抗原，但更为常见的是，使用的抗体是非标记的，而用标记的二级试剂来进行抗原定位。常用的标记方法有酶联法，一般是用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
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(一)印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭
尽管这些封闭液在某些情况下使用较为满意，但是仍需要仔细选择以确保其能适合于检测试剂。例如，若用A蛋白质作为检测试剂，用全血清封闭就不可取。取一张新鲜膜，先对其封闭，然后用检测系统测试便可了解2种试剂是否相匹配。
几乎适合于所有检测系统的两种封闭缓冲液是脱脂奶粉(Johnson等，1984)和牛血清白蛋白(Towbin等，1979)。若蛋白质—封闭液造成本底过高或干扰检测，则可试用吐温20封闭液(Batteiger等，1982)。
常用的封闭液
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封闭缓冲液
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组成
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优点
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缺点
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5％脱脂奶粉
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5％w／v脱脂奶粉溶于PBS中(w／v)
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价廉
背景清晰
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易变质
可掩饰某些抗原
不适合于亲合素／链霉亲合素技术
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5％脱脂奶粉／吐温
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5％脱脂奶粉溶于0．2％吐温20／PBS中(w／v)
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价廉
背景清晰
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易变质
可掩饰某些抗原
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吐温
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0．2％吐温20溶于PBS中
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可以在抗原检测后进行染色
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可能有一些残留的本底
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BSA
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3％BSA(Cohn fraction V)PBS
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价廉
信号强
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相对较贵
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若不愿每次新鲜配制封闭缓冲液，应加入o．01％硫柳汞制剂作为防腐剂。避免使用叠氮化钠，因其能抑制辣根过氧化物酶的活性。
(二)直接与间接检测方法
直接检测是指将第一抗体(一抗)纯化并标记的方法。该抗体与印迹膜结合后的本底较低，并且在同一张印迹膜上可同时使用来源或特异性不同的多种抗体。但直接法工作量较大，需自己制备试剂，灵敏度亦不如间接法。
间接检测是指先使用非标记的一抗，然后用可与一抗的表位结合的标记第二抗体(二抗)进行检测的方法。这种免疫复合物使得一种标记抗体(常用商品试剂)可以检测同一种属来源的所有一抗，同时由于结合了多个二抗分子具有放大效应，因而灵敏度较高。
因此，除非需要直接检测抗原的特异性，否则最好是选择间接法进行免疫印迹测定。通常，大多选用与辣根过氧化物酶结合的抗免疫球蛋白抗体商品试剂来检测一抗。这样可以使用少数几种检测试剂，分别针对不同种属来源的一抗。因此，一个实验室只需备用针对小鼠、大鼠、家兔和其他一抗的少数几种通用试剂即可满足各种免疫印迹试验的要求。
(三)化学发光检测方法
有多种有效的方法可用于检测印迹膜上与抗体结合的固定蛋白质的位置。近年来，化学发光(CL)法已成为最常用的方法。该法是基于环化二脂酰肼(cyclic diocylhy—drazide)的化学氧化作用，生成一种不稳定的中间产物，当其衰变时即可发光。发出的光可使标准X—光片感光，产生较易识别的图像。
化学发光法比过去使用的显色或放射活性检测法更加灵敏。尽管对灵敏度增加的幅度还有很多争论，但一般认为比显色法大约增高20倍，比放射活性检测方法约增高7倍。该法的关键是使用了辣根过氧化物酶—偶联的二抗试剂。辣根过氧化物酶可与抗免疫球蛋白抗体、A蛋白、G蛋白或其他可与一抗特异结合的试剂共价结合。在过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶催化鲁米诺(氨基苯二酰一肼)氧化后即可发光。
