提供了一种相对快速的、定性的比较不同底物相对酶解效率的替代方法。这种方法需要将底物序列展示于一个融合蛋白之中，此融合蛋白与筛选过程中使用的是同样的融合蛋白。之后，从融合蛋白中酶切下来的产物还可以通过N端测序分析得到易断裂键的序列。以碱性磷酸酶(AP)融合蛋白为例。然而，这种方法中还需要使用其他的一些指示酶类，例如荧光酶(luciferase)或辣根过氧化物酶(HRP)。 内容来自实验室前沿网站
[器材和试剂]
● 一个AP融合蛋白的胞内表达载体，此载体带有合适的限制性酶切位点，可以用于将筛．选出的克隆中的亲和性结构域及底物连接序列的PCR反应产物克隆到AP融合蛋白的N端。以hGH作为亲和性结构域进 行构建和测定酶活的过程
● 单链或双链的噬菌粒DNA，制备自筛选出的对蛋白酶敏感(或对于一个阴性对照来说有抗性)的克隆
● 适用于表达分泌蛋白的大肠杆菌菌株，例如，KS330
● LB+100ug/ml氨苄青霉素或LB+50ug/ml羧苄青霉素的琼脂平板或液体培养基
● 抗亲和性结构域标签的树脂(如对于hGH亲和性结构域，就可以用hGHR亲和性树脂
● 含1mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)的TE缓冲液 (10mmol/L Tris—HCl，1mmol/LEDTA，pH 7．6)
● 适用于要研究的蛋白酶的反应缓冲液
● 用作基准的纯化AP(Sigma)
● AP显色底物，例如磷酸对硝基苯酯(pNPP) (Sigma)
● AP底物缓冲液(由pNPP底物试剂盒提供)
● 非结合性的微孔板，例如Nunc 96F型微孔板(Nalge Nunc)
[方法]
A.AP融合蛋白的亚克隆和表达
1．使用来自筛选出的噬菌粒克隆的模版DNA，以及包含与AP融合表达载体的克隆位点相对应的限制性酶切位点的寡核苷酸引物，进行PCR反应。
2．通过琼脂糖凝胶电泳检测正确大小的扩增产物。选择相应方法对PCR产物进行纯化。
3．用对应于克隆位点的限制性内切酶消化PCR产物，使用标准的方法将此产物连接到相同酶切后的AP融合蛋白表达载体中。
4，通过标准的方法将连接产物转化入大肠杆菌中，铺到含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上。挑取单克隆，利用标准的方法(如限制性酶切或PCR)鉴定是否有插入序列。
5，在LB+100ug/m1氨苄青霉素培养基中，过夜培养少量(约5m1)的阳性克隆菌液。以l/100接种于适合所用诱导系统的表达培养基中。
6．用适合所用的诱导系统的方法培养细胞并诱导表达。7500g离心收集细胞，并弃去上清液。将细胞沉淀在一20℃冷冻超过4小时，或在酒精/干冰混合物上冷冻10分钟。
7．轻轻地将细胞重悬于TE+PMSF缓冲液中以释放胞质蛋白。 离心(7500g)沉淀细胞并收集上清液。
8．用一个因所用标签而异的方法进一步纯化融合蛋白。这将使融合蛋白的定量变得更容 易，并能除去可能影响酶解检测的杂质蛋白。但是，如果AP融合蛋白的表达水平较 高，也可以直接使用胞质裂解原液，因为检测中已含有一个有效的亲和性纯化步骤。9．用SDS—PAGE分析胞质蛋白和一系列浓度的基准纯化AP。用凝胶光密度测量法(gel densitometry)将样品中的AP融合蛋白水平定量。
