将微孔表面包被纯化的肺炎支原体抗原，将被稀释过的患者血清加入微孔中，如存在支原体抗体可与微孔上抗原相结合，然后洗去未结合物质，再加入酶标记抗人IgM与抗原抗体复合物结合，洗去未结合的酶标记抗体，最后加入显色液。在特定时间终止显色反应，通过酶标仪校正和对照相比读出结果。
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[标本准备] 取新鲜末梢血或静脉血。如采血后24h内不能进行试验，分离血清后将其保存于一20℃环境中。检测时，使样本恢复至室温。
[试剂]
1．预包被微孔板
2．阳性对照
3．弱阳性对照
4．阴性对照
5．标本稀释液
6．浓缩酶联物
7．底物A、B
8．终止液
[仪器] 酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。
[检测步骤]
1．配制洗涤液 1瓶浓缩洗涤液加475ml蒸馏水。配好的洗涤液短期内可置室温环境，长期可存于2—8℃环境中。
2．配制酶联物 按1：101倍稀释，即取10tzl浓缩酶联物加酶联物稀释液l 000ul(根据检测标本数量确定稀释量)，未用完的丢弃。
3．待试剂盒平衡至室温后，待测标本用按1：51稀释，取4ul血清与200u1标本稀释液混合。
4．将稀释标本置37℃环境中20min。
5．各加100ul阳性、弱阳性、阴性对照及已稀释待测标本上清液于相应孔中，空白对照孔加100ul标本稀释液，盖好反应板，37℃环境中孵育30min。
6．甩尽板中液体，每孔用200—300ul洗涤液洗5次，每次均需拍干。
7．每孔加酶联物100t~l，盖好反应板，37℃环境中30min。
8．甩尽板中液体，洗5次，每次拍干。
9．加底物A、B各1滴或各50P1，混匀，37℃环境中15min。
10．取出，加终止液1滴，用酶标仪450nm测其OD值。若肉眼观察，不加终止液判断结果。
[结果判断]
1．阴性对照平均OD值须小于0．20。
2．弱阳性对照平均OD值须在0．20～0．65。
3．弱阳性对照和阴性对照的平均OD值之比须≥2。符合以上3种条件时，本试验结果可信，否则重复试验。
4．若待测标本孔显色比弱阳性对照孔深则判为阳性，反之为阴性。但在弱阳性对照值上下10％范围内最好再测1次，如确实高于弱阳性对照则可判为阳性。
[注意事项]
1．本试验结果须结合临床表现、病史作出诊断，方可采取适当临床处理。
2．试剂盒内虽然含有消除干扰因子的物质，但仍可能会有少量标本难以除尽干扰。因此，如果某标本几项IgM均为阳性，应考虑有RF的干扰。
[临床意义] IgM抗体是早期抗体，于起病第1周末出现，用于早期诊断；IgG抗体是恢复期抗体，于起病2—3周后出现，动态观察可用于确定诊断。
