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考马斯亮蓝的两种染色法

时间:2010-07-10 15:26|来源:实验室前沿| 分享|点击:


考马斯亮蓝染色法——标准方法
 
    1.电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R—250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)。
    2.室温下振摇温育4h至过夜。
    3.去除染色液,收集保存可重复使用20~40次。
    4.依次在25%甲醇、7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵实验室前沿敏度为0.1~0.5ttg蛋白/每条带。
    注:①使用加热的染液或脱色液可以缩短染色或脱色的时间。将染液或脱色液在微波炉或水浴中加热(大约50-6013)。染色时间可缩短至20min,脱色时间约1—2h。②加入泡沫橡胶(海绵)、羊毛状物或其他物品吸收染料,可以加快脱色时间,特别是在室温下脱色时。
 
考马斯亮蓝染色法——快速方法
 
    1.将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料培养皿中加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%三氯乙酸中)。
    2.室温下振摇温育20min。
    3.去除染色液,收集保存可重复使用多次,用水洗去未与凝{实验室前沿}胶结合的染料。
    4.加入数倍体积的脱色液(25%甲醇、7%乙酸)。必要时更换脱色液,将凝胶加温或在脱色液中放入海绵、滤纸片等吸收残余的染料,有助于加快脱色。灵敏度为1.0ug蛋白/每条带。   
 
考马斯亮蓝染色法——最高灵敏度
 
    1.染色前,考马斯亮蓝G-250(系考马斯亮蓝R-250的二甲基化衍生物)必须纯化。因为商品制剂中的杂质可增强染色背景。在250m17.5%乙酸中溶解4g染料,加热到70℃;加入44g硫酸铵,溶解后,冷却过滤或置室温离心(3000g,10min),去除上清液,让染料干燥。实验室前沿
    2.配制染色液:在500m1 2%磷酸中溶解30g硫酸铵,待其完全溶解后,加入溶于10m1水中的0.5g纯化的考马斯亮蓝G—250。室温保存。
    3.电泳后,将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料容器中加入5倍于凝胶体积的12.5%三氯乙酸。
    4.室温下振摇温育1h或更长时间。
    5.排干液体。摇动考马斯亮蓝G—250染液,使大颗粒胶体分散,加至凝胶内。
    6.室温下振摇温育过夜。
    7.将染液倒回贮液瓶以备重复使用。用水或常规脱色液清洗凝胶并观察脱色效果。
    8.为了使胶体染料固定在蛋白质上,可再加入5倍体积的20%硫酸铵并于室温下振摇温育过夜。凝胶固定后,可重复染色增大灵敏度。从步骤5开始进行重复。灵敏度为0.05~0.1ttg蛋白/每条带。
Tags:马斯,
责任编辑:何辉

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