(一)蛋白质的分离
利用5%~20%梯度的SDS-PAGE、尿素—PAGE、等电点聚焦(1EF)—PAGE、双向凝胶或琼脂糖凝胶作为介质,对蛋白质样品进行分离,其基本操作与凝胶电泳一样。不同之处是,凝胶厚度需0.8mm,经分离后的凝胶(SDS-PAGE除外)要浸泡在含SDS的缓冲液中,使蛋白质带上负电荷,以利于凝胶中的蛋白质在电场中转移到正极边的NC膜上。因此,在分离蛋白质时,大多数是用SDS-PAGE系统进行的。不过,也有用非SDS-PAGE系统替代的,如用此系统进行转移操作时,则需将凝胶上的蛋白质转移到处于正极和负极端的两张NC膜上(即将凝胶置两张NC膜之间),该程序的灵敏度较低。
(二)NC膜的处理
取一张与凝胶条大小相等的NC纸(用手术刀切),浸泡在电泳转移的缓冲液(一般为25mmol/L Tris,191mmol/L甘氨酸,20%甲醇)中0.5h(国产NC纸浸泡2h以上)。
(三)凝胶的处理
样品在SDS-PAGE中电泳后,切下欲转移的凝胶条区段或将整个凝胶板浸泡在电泳转移缓冲液中0.5h,轻轻摇动除去胶中的SDS、巯基乙醇等物质,使凝胶中的离子强度与转移液相同,以利于蛋白质恢复其天然结构和生物学活性,防止凝胶的膨胀。
(四)准备海绵和滤纸
剪裁与NC膜大小相同的海绵和滤纸各两块,用电极缓冲液浸湿。
(五)“夹心饼”的制作
先把有孔洞的有机玻璃板放在干净的玻璃板上,然后盖上一块海绵,海绵上铺一层滤纸,接着小心地把凝胶平放在滤纸上,NC膜要端端正正地放在胶面上(一旦放下就勿拿起)。在NC膜上依次盖上滤纸、海绵和有孔洞的有机玻璃板。最后用橡皮筋捆紧,放入装有电极缓冲液的电场中。夹有凝胶的一端朝负极,夹有NC膜的一端朝正极。通电后调节电流为60mA左右(恒流),4℃环境下电泳6—18h。在制作“夹心饼”时,每两层之间不能有气泡,否则影响样品的转移。此外,电极液中应含有20%的甲醇,以防电泳过程中凝胶变形。分子质量大转移时间长,反之则时间短。通常转移过程也是进一步除去SDS和恢复转移物质的结构与生物活性的过程。
(六)鉴定
1.酶联免疫吸附测定法(ELISA) (1)试剂:①PBS液,含0.15mol/LNaCl的0.025mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.4;②PBS-T液,含0.3%吐温的PBS液(淬灭剂);③HBP-IgG溶液,HRP-人抗体复合物溶液;④联苯茴香胺溶液,50mg联苯茴香胺溶于10ml甲醇中;⑤染色液(用前配制),取27ml bPBS-T液,3ml联苯茴香胺液,35ul3%过氧化氢溶液混匀。
(2)染色:印迹后的NC膜在50~200mlPBS液中漂洗5min,除去粘在NC膜上的凝胶,而后在PBS-T或PBS-BSA(含3%的牛血清清蛋白的PBS)溶液中,37℃环境下,手摇振荡15min(封阻反应),与酶标记物溶液20ml(1;25,稀释度视HRP活力高低而定)反应2h(37℃环境下),再用PBS、PBS-T或PBS-BSA分别漂洗。接着转入30ml(如膜为4cmX8cm时)染色液浸泡5min左右,即可显出特异的抗原棕色谱带(注意:一旦谱带显示立即取出),用蒸馏水漂洗后,密封保存于4℃的蒸馏水中。
2.放射自显影术 封阻后的NC纸与放射性核素标记的抗体或其他相应的配体进行反应,接着经过漂洗、烘干、压片和冲洗,即可呈现自显影谱带。
除上述鉴定方法以外,使用印度墨水、天津绘图墨水、氨基黑和考马斯亮蓝等试剂也可进行染色,以鉴定印迹在NC膜上的蛋白质谱带。