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细胞内细胞因子的测定

时间:2011-03-12 00:53|来源:实验室前沿| 分享|点击:


采用FCM免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的细胞因子,用两种不同的荧光素分别标记不同的抗体可在同一细胞内同时测定两种不同的细胞因子。甚至可利用多种参数流式细胞术对胞内多种细胞因子进行测定。 内容来自实验室前沿网站

    1.PBMC的分离  通过淋巴细胞分层液分离PBMC,用含10%FCS、50~mol/L 2—巯基乙醇、1mmol/L丙酮酸钠的RPMI-1640培养液将细胞配成2X106/mL。
 
    2.细胞培养与收集  取6孔细胞培养板,每孔加2mL细胞悬液,2gmol/L莫能菌素(monensin,抑制细胞分泌细胞因子),l/~mol/L艾罗霉素(ionomycin)和20nS/mLPMA刺激细胞产生细胞因子。在37~C,5%C0)条件下培养适当时间,根据实验需要可用不同的方法刺激细胞,诱导细胞因子的产生。用4~CPBS洗细胞1次,留少许液体悬浮细胞,使细胞完全分散。
 
    3.细胞固定  于每管中加4%多聚甲醛(用pH7.4,0.1mmol/L磷酸缓冲液配制,置37℃预温)3mL,充分混悬细胞,固定细胞5min。加入0.1%BSA-PBS 12mL,混匀以终止反应。1 500r/rain离心lOmin,去上清后进行封闭和染色(亦可用lmL含10%DMSO的PBS悬浮细胞,分装保存于—80~C备用)。
 
    4.封闭非特异性结合位点  取上述固定的细胞(或复苏冻存的细胞,用0。1%BSA—PBS洗涤细胞2次),用悬浮液(含5%脱脂奶粉的PBS-Ca-Mg:1mmol/L Ca2+、1mmoL/LMg2+、0.1%皂角苷和0.1%BSA的PBS)悬浮细胞至106/lOOpL。室温作用1h,封闭非特异性结合位点和增加细胞膜的通透性。
取96孔塑料软板或V型底离心管,每孔(管)加入20gL细胞,离心去上请。用悬浮液稀释不含特异性抗体的同种抗体0.1mg/mL以封闭非特异性结合位点,同样将未标记的抗细胞因子的单抗稀释至0.1mg/mL。分别于每孔(管)加入50gL同种抗体(为染色试验管)、未标记抗体或含100~1 000倍量细胞因子的悬浮液(未标记抗体或过量的细胞因子可以封闭特异性结合位点,作为阴性对照)。置室温1h。
 
    5.染色与分析  加入荧光素标记的抗细胞因子单抗,4~C作用30rain,用PBS-Ca-Mg洗涤细胞3次,将细胞悬浮于0.1%BSA-PBS中,进行FCM分析。亦可同时加人不同荧光素标记的抗细胞表面分子的单抗,与细胞作用后,可同时分析分泌细胞因子的细胞。
Tags:测定,细胞,
责任编辑:何辉

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