原位杂交组织化学常用试剂及处理(2)
时间:2009-12-30 03:10|来源:实验室前沿| 分享|点击:次
（4）Vectabond粘附剂
该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：
标本（铺片、切片等）→丙酮（5min）→Vectabond试剂工作液（5min）→dH2O(2×5min)→干燥（温箱，数小时过夜）→用铝箔包好，室温备用。
注意：制备和保存过程中避免污染。
经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4℃可更长）。
（五）硅鱼精子DNA的制备
（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；
（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（2～3min）；
（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置50℃15min助溶；
（4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；
（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）；
（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.0～7.5；
（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20μl DNA液混合于980μl水中，混匀后测定，吸收值乘以50即为DNA浓度（μg/ml）；
（8）制备好的DNA液储于-20℃备用，用前取出冻融后煮沸。
二、关于探针的标记
（一）cRNA探针的同位素标记
1．标记液（转录标记）
2．转录缓冲液
※：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。
3．标记终止液
4．标记探针水解液
先用dH2O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60℃条件下反应。
5．探针水解时间
注：LO－探针初始长度（kb）
Lf－探针的终长度（kb）
K－0.11kb/min
6．探针水解终止液
每次加入充分混合，临用前配。
7．探针沉淀液
每次加入，充分混合，新鲜配制。
（二）寡聚核苷酸3’端标记（cRNA探针）
1．标记反应液
2．终止液：0.2mol/L EDTA
3.探针沉淀液
（三）cRNA探针非同位素标记（地高辛及生物素）
1．标记液
△：生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP
※：为检测标记率而加。
2．转录标记终止液
（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法
（2）生物素标记终止液：
（四）DNA探针标记常用试剂的配制
（1）10 ×缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。
（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。
（3）DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10μl分装，-20℃保存一年。
（4）10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。
（5）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亚精胺。
（6）10×随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L β-巯基乙醇；500μg/ml BSA。
（7）1×加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。
（8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。
（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。
（10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45μm膜过滤，室温保存。
（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。
（12）20×SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。
（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。
（14）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。
（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。
（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。
