原位杂交组织化学常用试剂及处理(4)
时间:2009-12-30 03:10|来源:实验室前沿| 分享|点击:次
细菌培养用琼脂（或琼脂糖） 15g
液体培养基（如LB） ～1000ml
按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。
五、小量质粒提取主要液体
1．溶液Ⅰ
2．溶液Ⅱ
3．溶液（3mol/L醋酸钠）
加热溶解后，再用冰醋酸（约40ml）调pH至4.8，补足H2O至200ml。
六、杂交前处理
1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：
精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。
（2）工作液（临用前配）：
取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。
（3）关于P-K缓冲液的配制：
称取上述试剂，充分混合即可。
②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：
先将Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。
③0.5mol/L的EDTA：
称取EDTA溶于约600ml ddH2O中，常需60℃持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。
2．甘氨酸
（1）1mol/L甘氨酸：
称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。
（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：
将二者按1：10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。
甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。
3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐
配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。
生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。
4．RNA酶溶液
取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20℃储存。
临用前，取RNA酶A储备液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.
5.0.2%
取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。
七、杂交用液
1．SSC（Standard Saline Citrate, SSC）
通常配成10×，20×，50×的储备液，如下：
配制：先称取上述两种试剂，溶于约800ml ddH2O中，滴加10N的NaOH，将pH值调至7.0，补足ddH2O至1000ml，加入终浓度为0.1%～0.2%的DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。
该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用5×的SSC以保持一定湿度。
2．Denhardt’s液
通常配成10×，50×或100×的储备液
配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddH2O中，定容至1000ml后，过滤后于-20℃保存备用。
该液用于配制杂交液及予杂交液等。
3．杂交液及予杂交液
※：临用前加；△予杂交液不加
配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4℃，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染。
变性被打断的无关DNA（常为鲑精DNA或鲱精DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。
配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50℃，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.5～2μg/ml，DNA探针浓度为1μg/ml,此外，如使用35S标记的探针，还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交液及杂交后的洗脱液中。
八、杂交后漂洗溶液
无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。
该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。
该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2×SSC，10%（0.1%）SDS洗脱。
主要是洗去残留的RNA，降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。
4．Dig标记探针杂交后处理液
用ddH2O溶液并定容至1000ml。
用ddH2O溶解并定容至1000ml。
配制同上。
左旋咪唑有消除内源性磷酸酶的作用。
九、原位杂交信号显示
